125 I 近距离放疗联合热疗对人胶质瘤细胞毒性的研究

唐知已,章文斌,张锐,杨坤,胡新华,阎华,刘宏毅

【摘要】目的研究"”I近距离放疗联合热疗对人胶质瘤细胞的治疗效果。方法收集临床胶质瘤手术肿瘤标本进行体外细胞培养,分为热疗联合放疗组,放疗组,热疗组,空白对照组,MTT法测定各组细胞经处理后的抑制率,ranswel 侵袭小室测定各组细胞侵袭力变化。结果与对照组相比,各处理组的细胞抑制率显著增加,侵袭力显著降低,且随着温度的升高,热疗联合"”「近距离放疗对细胞的抑制率和侵袭力影响也有显著变化。结论1近距离放疗联合热疗对胶质瘤细胞具有一定杀伤作用。

【关键词】 胶质瘤细胞:近距离放疗;热疗

【中图分类号】R739.91【文献标识码】A【文章编号】1672-7770(2010)01-0014-03

胶质瘤以高侵袭性、预后差为显著特点,必须施行手术、化疗、放疗等综合治疗方案。其中近距离放射治疗对于恶性胶质瘤的疗效近年来逐渐被人们所认可,而温热疗法作为恶性胶质瘤的另一种方法近年来也已取得了一些成绩中。本实验采用"1近距离放疗和热疗相结合的方法对体外培养人胶质瘤细胞进行作用以观察两者结合的治疗效果。

1、材料和方法

1.1标本10例标本取自2008年10月至2009年1月间本院手术切除并且术后病理证实为WHOII级的胶质瘤。

1.2 实验用品Transwell小室(购于Chemicon公司);21粒子(购于上海欣科医药有限公司,剂量为0.3mCi/粒);MTT,DMSO等(购于Sigma 公司);小牛血清(购于Gibco公司);液体DMEM 高糖培养基(购于 Hyclone 公司)。

1.3 胶质瘤细胞的培养术中显微镜下取靠近肿瘤中心部位无坏死小块组织。无菌环境下，用D-Hanks液冲洗三遍,剪去血管血凝块等杂质,加人0.25%胰酶吹打,置于37°C细胞培养箱中消化5min,加人含10%小牛血清的DMEM培养基终止消化,吹打后400目细胞筛过滤,滤液800pm离心10min,弃去上清再次用培养基混匀,800pm离心5min,弃去上清,用培养基吹打成细胞悬液接种于细胞培养瓶中,24h后冲洗培养瓶将悬浮的杂质去掉,继续培养贴壁细胞,待细胞融合80%以上可以传代,最后得到数瓶单一患者的胶质瘤细胞样本。每个肿瘤细胞样本分为单纯放疗组,单纯热疗组(温度分别为41°C、42°C、43°C),热疗放疗结合组(温度分别为 41°C、42°C、43°C),空白对照组。1.4 细胞的处理

1.4.1 近距离放疗 将胶质瘤细胞用0.25%胰酶消化后接种于6孔培养板中,贴壁铺满孔底80%后,每孔放置9粒1粒子,孔周边等距离放置8粒中心部位放置1粒,模拟肿瘤放置粒子,使得圆形底面剂量分布平均,培养箱中放置 24h[2]。1.4.2热疗将6孔板的每孔细胞消化吹打,移至离心管中,放置于水浴箱中模拟热疗,水浴箱温度分别调节为41°C,42°C,43°C,热疗时间为1 h。1.4.3近距离放疗合并热疗将热疗结束后的细胞接种于6孔板中,按照近距离放疗的方式再进行处理。

1.5 MTT法测不同处理方式对胶质瘤细胞的抑制率收集每组细胞,调整细胞悬液浓度,96孔板中每孔加入100ml,使细胞密度为每孔6000个。每种处理因素设5个复孔。2.5%CO,,37℃孵育24h,每孔加人20 IMTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT)继续培养4h。终止培养,吸去孔内培养液。每孔加人150WIDMSO,置摇床上低速振荡10min,在酶联免疫检测仪 490nm处测量各孔的吸光值。设置调零孔(培养基、MTT、DMSO),对照孔(细胞、培养液MTT、DMSO)。抑制率=(对照组0D-试验组0D)/对照组 OD。

1.6 Transwell侵袭小室测各种处理方式对细胞侵袭力的影响 每个肿瘤细胞样本分组及处理同上。将处理后的细胞调整细胞浓度为5×10°移入24孔transwell板中150wl,内含无血清DMEM 培养基,下层为含血清DMEM培养基,每组设3个复孔,常规培养24h后下层24孔板加人500w含0.5 mg/m)MTT的完全培养基,将小室置于其中,使膜浸没在培养基中,37℃12h后取出。96孔板中加人500mDMS0,将小室置于其中,使膜浸没在DMS0中,振荡10 min,取出小室,24孔板于酶标仪上490 nm测OD值。以各组的 OD 值间接反映穿过小室的细胞数。

1.7 统计学分析统计学分析使用t检验,P值设定为0.05,由SPSS11.0软件完成。

2、结果

2.1不同处理对10例胶质瘤细胞抑制率两两比较结果:(1)单纯近距离放疗和41℃热疗对细胞抑制率

影响没有统计学差异(P=0.428)(2)42℃热放结合和单纯43℃热疗对细胞抑制率没有统计学差异(P=0.848)(3)与单纯放疗相比,41℃热放结合,42℃热放结合,43℃热放结合对细胞抑制均有显著差异,且随着温度的升高,差异越明显(表1)。

试验组与对照组比较*P<0.01;试验组内与37℃放疗比较“0.05;试验组内与42℃比较"P>0.05;实验组内其他组两两比较均有显著差异

2.2不同处理对10例胶质瘤侵袭力的影响比较结果:(1)单纯近距离放疗和41℃热疗对细胞侵袭力影响没有统计学差异(P=0.861)(2)41℃热放结合和单纯42℃热疗没有统计学差异(P=0.497)(3)42℃热放结合和单纯43℃热疗没有统计学差异(P=0.433)(4)42℃热放结合和单纯42℃热疗没有统计学差异(P=0.082)(5)与单纯放疗相比,41℃热放结合,42℃热放结合,43℃热放结合对细胞侵袭力均有差异,且随着温度的升高,差异越明显(表2)。

试验组与对照组比较"P<0.01，;试验组内与37℃放疗比较“P>0.05;试验组内与41℃热放比较"P>0.05;试验组内与42℃比较"P>0.05:试验组内与42℃热放比较P>0.05;实验组内其他组两两比较均有显著差异。

3 讨 论

对于胶质瘤的治疗已不仅仅是手术切除,越来越多的学者及临床工作者开始关注综合治疗策略，近距离放疗作为一种局部疗法有着显著的特点将半衰期较长,组织穿透力较弱的放射源直接置于肿瘤内,对肿瘤进行照射,而射线对周围正常组织影响微弱,达到对肿瘤最大的照射和对正常脑组织最小的损害。关于脑胶质瘤的近距离放疗已有较多临床报道证实125 I 粒子对周边组织的放射性影响较轻,是临床放射治疗的较好选择方法。本试验中,胶质瘤细胞经125 I 粒子照射后的抑制率和侵袭力较对照组都有显著差异,说明125 I 有明显的细胞杀伤及抑制作用。放射对胶质瘤细胞抑制的机制尚未完全阐明,细胞周期的调控是多基因参与的一个复杂的过程,不同肿瘤的基因调控途径不同。研究表明胶质瘤细胞经过射线照射后 DNA合成以及修复受到了阻滞,主要作用于细胞的G1、S期,这是使用放射治疗胶质瘤的作用所在。国内学者[9使用125 I 粒子对C6胶质瘤细胞进行照射,观察细胞病死率以及增殖率的变化,发现胶质瘤细胞经过”125 I 粒子照射后DNA合成受到影响,S期细胞数目减少,增殖受到抑制,125 I 粒子能够通过直接细胞杀伤作用以及诱导细胞凋亡而共同作用于肿瘤细胞，

温热疗法是采用加热装置在肿瘤内部加温导致肿瘤细胞损伤。温热疗法对瘤细胞的作用机制可能有:(1)加温使生物膜的脂流动性增加和激发膜脂质过氧化反应,使得与膜流动性相关的功能受损从而损伤和破坏肿瘤细胞的膜性结构;(2)抑制瘤细胞 DNA 双链的修复使肿瘤细胞损伤;(3)肿瘤处于低氧低pH的状态,加热能使肿瘤内部酸性环境更加严重,并且加重肿瘤组织的缺氧,间接对其造成杀伤作用。有研究表明温度对于S期的细胞作用明显,而大量处于S期的肿瘤细胞是抵抗放疗的主要原因。通过热疗能使大量细胞停滞在G2，后期和M 期,此期又对放射敏感,两者相辅相成使得更多肿瘤细胞调亡。此外,决定肿瘤复发及转移的侵袭性蛋白如基质金属蛋白酶家族,乙酰肝素酶,血管内皮生长因子等亦受到放射及加热的影响而使得这些侵袭性蛋白表达受阻,从而抑制肿瘤侵袭性。本实验针对近距离放疗联合热疗对细胞毒性作用进行了细胞学的研究,结果与单纯放疗相比,放疗与热疗结合可影响细胞的增殖及侵袭,且随着温度的升高,肿瘤细胞抑制率增加。侵袭性随温度升高而降低。这说明热疗与放疗在对胶质瘤细胞的杀伤中起了协同作用。同时结果表明,42℃热疗结合近距离放疗时对瘤细胞生长抑制率及侵袭性的影响与单纯43℃热疗组之间的结果没有统计学差异。肿瘤细胞在低于43℃及高于43℃时的生存曲线不同，低于43℃细胞生存曲线比较复杂且随着时间延长生存率降低较缓和,而高于43℃生存率降低变化显著,且影响范围增加。实际上超过43℃虽然可以使得大量肿瘤细胞坏死,但可能引起周围正常组织蛋白的不可逆变性。而使用相对缓和的42℃合并近距离放疗同样能达到杀伤肿瘤细胞的目的,同时也避免损伤正常组织。因此临床应用时在疗效相当的情况下选择相对较低的温度使得疗效最大化的同时尽可能使周边组织损伤最小化,适用于某些无法手术完全切除的重要功能区,如中央前后回,语言功能区的胶质瘤。

试验结果表明,125 I 近距离放疗合并热疗作为胶质瘤综合治疗方案之一,有一定的细胞学理论依据,与单纯放疗或单纯热疗相比,近距离放疗联合热疗对胶质瘤细胞的毒性作用都有统计学意义。